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一文带你了解分子生物学研究技术:聚合酶链式反应(PCR)

2022.03.28

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01
什么是PCR

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,其是一种用于放大扩增特定的DNA(或RNA)片段的分子生物学技术。这种技术模拟体内DNA的天然复制过程,能将微量的DNA进行特异性的扩增,在短时间内获得足够的DNA,是分子生物学研究中不可缺少的一员。

02
标准PCR的过程

此项技术是模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,在整个PCR过程中包含了变性——退火(复性)——延伸三个基本反应步骤。

  • DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。

  • 退火(复性)(40℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

  • 延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。

03
为什么要使用梯度PCR仪呢

梯度PCR仪是指一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件的仪器,因为不同的DNA片段其最适退火温度不同,采用梯度PCR仪通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适退火温度,优化反应条件,进行有效的扩增。

在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。

使用普通的PCR仪进行扩增时,只能运行一个特定的退火温度,当目的基因的退火温度不适时,就可能出现假阳性,影响实验结果。而对于梯度PCR仪,不但可以作为普通PCR仪使用,也可以通过设置不同的温度梯度(通常为12个梯度温度),研究未知DNA退火温度的扩增,有效降低或避免假阳性,同时在不理想的工作条件下扩增出产物,既节约成本也提高了实验效率


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