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超全鞘内给药置管方法,这些要点快来了解!

2022.02.14

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鞘内给药通过将药物直接注入脑脊液,绕过血脑屏障进入中枢神经系统,是研究脊髓水平药物作用机制的常用给药方式,广泛用于损伤、疼痛、中枢神经系统疾病以及癌症治疗等研究领域。通过鞘内置管,可以使药物根据需求有选择性地注入脊髓,如接入缓释泵进行持续输注(参考文章👉),或者注射器等多次注射。常用的鞘内给药置管方法包括经延髓池(cisterna magna)鞘内置管和腰椎脊髓鞘内置管。


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一、小脑延髓池置管
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1
实验仪器耗材

脑立体定位仪、体视手术显微镜、吸入式麻醉机、加热垫、手术器械、缝合线、70%酒精、组织粘合剂、32G鞘内PU导管(带结节用于锚定组织)等。

2
实验步骤

 麻醉 

  1. 小鼠置于诱导盒内给予4%的异氟烷麻醉。

  2. 确认老鼠在失去反应能力后,用电动剃须刀将动物颈部到头部的的皮肤脱毛。

  3. 将耳杆正确插入小鼠耳道进行定位仪固定,嘴部置于口部麻醉面罩上以持续麻醉(2%异氟烷),加热垫(37℃)维持体温。

  4. 70%乙醇擦拭剃毛部位皮肤进行消毒,可涂抹眼药膏保护小鼠眼睛。

 暴露寰枕膜 

  1. 用手术刀沿颈部中线(枕骨嵴处)做一个2-3厘米长的纵向皮肤切口。

  2. 继续沿皮肤切口向下切开枕骨上方肌肉,用手术挂钩将肌肉从枕骨拉至两侧固定,暴露寰枕膜。

  3. 显微镜视野下用剪刀小心地在寰枕膜开一个缝,暴露脑干。此时脑脊液会从由此切口渗出。注意寰枕膜切口要尽可能浅,避免损伤脑干。

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寰枕膜解剖图[1]

 置管 

  1. 移动定位仪面罩,调整小鼠头部,使头部朝下与身体成90度角。

  2. 将导管修剪到所需长度,显微镜视野下轻轻将导管插入延髓池。保持导管角度与脑干的背侧表面平行,向尾部方向缓慢推进到脊柱内所需位置。

  3. 采用组织粘合剂将导管结节固定在颅骨上,取出手术挂钩缝合两边肌肉进一步稳固结节,确保鞘内导管长期稳定。

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小脑延髓池(cisterna magna)置管[1]

 可选操作:缓释泵鞘内给药 

  1. 选择缓释泵鞘内给药方式需预先进行缓释泵灌充、鞘内导管连接、泵体孵育等准备操作参考(参考文章👉)

  2. 用止血钳自颈背部切口分离背部皮下组织,打通皮下隧道形成空隙。

  3. 将缓释泵植入空隙中,使用缝线将所有皮肤切口缝合完整。

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缓释泵小脑延髓池置管输注[2]

 术后恢复 

  1. 可在术后给予腹腔注射5%葡萄糖,补充能量                      

  2. 为预防术后感染,可服用预防性抗生素如恩诺沙星等。

  3. 定期检查小鼠是否有肢体功能障碍、疼痛或手术不良反应,剔除影响实验的不良个体。

 注意事项 

  1. 切开寰枕膜时很容易损伤脑干,要尽量从表面切开,注意不要压迫脑干,可能会导致呼吸抑制。

  2. 将头部屈曲90°角对于导管正确进入延髓池及后续插入非常关键。

  3. 导管插入过程必须注意确保动物脊椎笔直,可以通过轻拉尾巴施加张力以使脊椎对齐。

  4. 注意切割方向应与动物背部平行,避免损伤深层肌肉层或其他组织结构。


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二、腰椎脊髓鞘内置管
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1
实验仪器耗材

体式手术显微镜、吸入式麻醉机、加热垫、钻子、手术器械、缝合线、70%酒精、组织粘合剂、32G鞘内导管(带结节用于锚定组织)等。

2
实验步骤

 麻醉 

  1. 小鼠置于诱导盒内给予4%的异氟烷麻醉。

  2. 确认老鼠在失去反应能力后,用电动剃毛刀将背部皮肤脱毛。

  3. 持续给予麻醉(2%异氟烷),将小鼠置于加热垫(37℃)维持体温。

  4. 70%乙醇擦拭剃毛部位皮肤进行消毒,可涂抹眼药膏防止眼睛干燥

 暴露脊柱 

  1. 用手术钳和手术刀在背部中线处做一个2-3厘米长的纵向皮肤切口。

  2. 识别第六腰椎(L6)的脊柱突,用手术刀切开L6-L2脊柱突周围肌筋膜。用镊子将肌肉组织从椎板中分离出来,用手术挂钩将肌肉拉至两侧固定,暴露L6/L5椎板。

  3. 显微镜视野下用钻子在椎板上钻孔直到剩下薄骨层,避免钻透。脊髓组织此时可以透过骨层看到。

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腰椎切口示意图[3]

 置管 

  1. 显微镜视野下小心将钻孔切开小缝,此时脑脊液会由此切口渗出。注意避免脊髓或其血管受伤。

  2. 将导管修剪到所需长度,在显微镜视野下将导管轻轻插入鞘内间隙。保持导管角度始终平行于脊髓,向头部方向缓慢推进到脊柱内所需位置。

  3. 取出手术挂钩缝合两边肌肉将导管结节稳固在肌肉内,确保鞘内导管长期稳定。

  4. 用止血钳自背部皮肤切口往小鼠头部方向分离背部皮下组织,打通皮下隧道,将导管回绕顺着皮下隧道从颈部穿出。

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腰椎置管[4]

 可选操作:缓释泵鞘内给药 

  1. 缓释泵准备工作同上

  2. 用止血钳自背部皮肤切口往小鼠头部方向分离背部皮下组织,打通皮下隧道形成空隙。

  3. 将缓释泵植入空隙中,注意此时泵体应该处于胸背部,缓释泵流量调节器应该对准尾巴方向(注意不能往尾部方向打通隧道,因为将泵体放置在髋骨上方,可能引起局部骨刺激)。

  4. 使用缝线将所有皮肤切口缝合完整。

 恢复 

同上所述

 注意事项 

  1. 导管插入过程必须确保始终平行于脊髓。这样有利于插入,同时降低神经损伤风险。

  2. 导管插入较小的鞘内间隙如中段胸椎脊髓时,可能引起脊髓炎症和压迫,应特别小心。

  3. 正确的导管插入过程应顺利进行,推进过程中出现推进不顺畅,动物甩尾或腿跳动等现象都反映插入不良,可稍微抽出导管并尝试再次插入。

  4. 缝线不要太紧,因为如果缝线太紧,可能会影响导管的通透性。


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【参考文献】

1.Seung AC, et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 2016;16(1):723

2.Malkmus SA, et al. Intrathecal catheterization and drug delivery in the rat. Methods Mol Med. 2004; 99:109-21

3.Mazur C, et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. J Neurosci Methods. 2017; 280:36-46

4.Wu WP, et al. Chronic lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in mice. J Neurosci Methods. 2004;133(1-2):65-9


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