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你问“沃”答︱肾穿组织制片的5大技术要领有哪些?

2022.03.18

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上一期从取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、到染色,我们了解到高质量的肾脏制片应该如何操作,接下来分享制作过程中的技术要领,快来看看这5大技术要领你都做到位了吗?


技术要领

1、动作轻,勿挤压标本,不宜过长时间暴露标本,保持标本的湿润性。

2、固定液应为标本体积的10倍。装瓶后及时加盖,并在瓶上做好相关信息标注。

3、标本置于4℃冰箱中保存待检。

4、染色流程大致如下:

(1) 脱水、透明、浸蜡、包埋、切片

①80%乙醇:10min

②95%乙醇:10minx3

③无水乙醇:15minx3

④二甲苯:10minx2

⑤浸蜡1(56~58℃石蜡):20min

⑥浸蜡2(56~58℃石蜡):60min

⑦包埋

(2) 2um厚连续切片,裱于多聚赖氨酸处理的玻片上,60℃烤片3h。

(3) 二甲苯脱蜡5minx3,100%、95%及75%Z醇各5min、水洗5min。

(4) 高压处理:切片浸人已沸腾的0.01mol/L  pH6.0枸橼酸盐缓冲液中,盖上锅盖及压力阀,加热至喷气,1~2min后,压力锅离开热源,自然冷却2~3min,水冲冷却至室温,打开锅盖,取出玻片,水洗2min。

(5) 3%H20210min,PBS洗2minx3;即用型胰酶37℃消化10~15min,PBS 2minx3。

(6) 5%EA-1/500NaN3稀释的工作浓度一抗37℃1h,PBS 2minx3

(7) 聚合物增强剂 37℃ 20min,PBS 2minx3

(8) 二抗(HRP-多聚鳌合物-抗兔IgG)37℃ 30min,PBS 2minx3

(9) 即用型 AEC 显色1~3min,水洗2min,无水乙醇苏木素1~3分钟,水洗3分钟,AEC封片剂封片。

5、肾穿刺组织固定、脱水、包埋、切片及抗体染色在内的各个环节的控制,主要有以下几点:

(1) 夏季炎热,含甲醛的固定液固定肾穿组织,固定时间不宜长,最好不要过夜,否则会降低阳性结果。

(2) 肾穿刺组织的脱水提倡手工脱水。

(3) 肾穿标本应先用标明病理号的拭镜纸包好,再放入乙醇中脱水,脱水必须彻底,每次取出标本时,应先将液体烘干后,再放入下一瓶液体中。每瓶液体量在150ml左右,每瓶液体用过3~4次后,向前移位1格。例如把95%乙醇Ⅲ改为95%乙醇Ⅱ,依次类推。这样既可保证脱水液的浓度,又可大量节省试剂。

(4) 石蜡的熔点可以用56~58℃,也可以用60~62℃,根据实际情况自行掌握。

(5) 肾组织在纯乙醇、二甲苯和浸蜡过程中不宜放置过久。否则会造成组织脆硬,切片破碎。

(6) 病理刀片要求锋利。蜡块应先放在冰块或冷台上冷却,保证蜡块足够的硬度,切出2μm厚的切片。

(7) 载玻片必须经过预处理。

(8) 强调将高温高压处理与胰酶消化结合使用,这样可以充分暴露免疫沉积物的抗原位点,提高阳性显色强度。如果单独使用其中一种方法效果都不太理想。

(9) 选购一抗时要注意抗体编号、选择适合免疫组织化学的抗体。一抗的工作浓度需结合说明书的提示,做预试验确定。采用5%鸭蛋清,1/500NaN3,PBS稀释一抗比预先用10%血清封闭切片的效果好

(10) 胰酶消化为重点控制,要根据室温和试剂批号对胰酶的消化时间进行调整。需通过预实验来确定消化时间,可参照肾小球毛细血管内浓缩的血浆蛋白着色情况加以调整。如果发现肾小球毛细血管内浓缩的血浆蛋白也出现着色,就要适当延长消化时间;如果延长消化时间后阳性着色明显减弱,就要缩短消化时间。消化时间控制在毛细血管内无着色为佳。此外,冬季室温较低时一抗和二抗需置于37℃孵育。


【参考文献】

1、病理技术大讲堂1001问-病理技术操作疑难点解惑答疑. 席越,陈军主编.人民卫生出版社


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