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淋巴组织制片中都有哪些常见问题?应如何应对?

2022.02.23

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通过上一期👉我们从制片流程到技术要领,get到了一张精良淋巴结组织制片的要领。由于淋巴组织制片难度相对其他组织更大,制片过程中难免会遇到很多棘手的问题,靠自己又很难找到解决方法,今天特意找到淋巴组织制片中13个常见问题及相应对策,助你淋巴组织制片更高效。


1
“极化”现象

> 原因:

上期说到淋巴组织的特性,若固定时没有将其剖开或固定时间不足,固定液短时间难以渗透到组织内部,由此造成靠近边缘部分的组织固定尚可,深部组织固定欠佳的“极化”现象。浸蜡时,组织蜡块的中间会出现成片的“灰白”区域。

>> 对策:

取材时应首先仔细剔除周边脂肪组织,沿纵轴剖开取0.3~0.4cm厚的淋巴组织,立即固定于新鲜的4%中性缓冲甲醛液中。甲醛固定液对组织的穿透率为1.14mm/h,需要固定3~5小时左右。


2

切片时组织脱落脆裂

> 原因:

组织水分的残留影响了正常的脱水、透明及浸蜡,浸蜡阶段受温度影响组织受热后造成硬脆,导致切片时出现脱落、脆裂现象。

>> 对策:

首先在取材时应剔除淋巴组织外面的被膜,若切片时出现硬脆的淋巴组织,可以将组织蜡块短时间浸泡在沾有5mol/L盐酸的纱布或脱脂棉上,达到暂时软化组织蜡块的作用,为避免组织蜡块过硬,蜡块无须冷冻,直接在室温下切片,即可防止切片裂隙的出现。用此法处理不会损伤组织,也不影响切片的染色。


3
标本固定过度切片时产生脆裂

> 原因:

使用的固定液在成分和浓度方面不标准、不统一、结果导致标本固定过度切片时产生脆裂。

>> 对策:

建议使用4%中性缓冲甲醛固定液或FineFIX固定液进行固定。


4
标本脱水过度切片时产生脆裂

> 原因:

由于大小标本混合处理,故常常会导致标本处理不均匀。特别是没有考虑到淋巴组织细胞多、含水少的特殊性造成含水多的组织脱水适中,而含水少的标本脱水过度,切片时产生脆裂。

>> 对策:

确保淋巴组织充分固定后开始脱水。来不及固定的淋巴组织标本最好固定过夜再上机处理或在上机处理前用56℃水浴加温的方式进行补充固定处理。固定好的淋巴组织建议从低浓度乙醇开始脱水,在95%乙醇中的时间应长一些,共需3~4小时,使淋巴结组织及少许脂肪组织能够彻底脱水。


5
组织收缩、变脆和硬化

> 原因:

传统的石蜡切片制作通常采用二甲苯透明,但二甲苯使用不当很容易引起组织收缩、变脆和硬化。淋巴结组织更是如此。

>> 对策:

把握处理时间不能过长、不能加温、液体要及时更换。因硬脂酸对组织具有软化兼透明的作用,使用硬脂酸处理标本后,组织质地柔韧,所以建议用硬脂酸和石蜡混合替代二甲苯进行处理。硬脂酸和石蜡混合液二道,第一道比例为3:2;第二道比例为2:3;时间均为60分钟,加温60℃加压、搅拌。浸蜡程序二道均为56~58℃纯蜡,时间60分钟加温60℃,加压、搅拌。这样可有效地避免组织的收缩、变脆和硬化。


6
切片出现裂缝或染色不均

> 原因:

石蜡的熔点过高会导致淋巴组织内出现裂缝或淋巴组织周围变硬,而组织中心浸蜡不佳。脱水机浸蜡槽内石蜡液面不够造成组织浸蜡处理失败,而出现切片染色不均。

>> 对策:

用56~58℃熔点的石蜡、浸蜡温度设置为58℃,将浸蜡步骤分3步进行,每步1小时即可。将浸好蜡的淋巴结组织立即包埋于58~60℃的石蜡中,包埋时组织不要在空气中停留过久,防止组织与石蜡之间留有间隙。组织包埋时,包埋盒背面应及时补充石蜡,防止切片时产生振动,影响切片质量。每天监测浸蜡槽内石蜡的液面高度保证浸蜡槽内的石蜡在有效的高度。


7
组织切片不完整

> 原因:

淋巴组织固定不足,脱水、透明及浸蜡无法正常完成;组织缺少相应的支撑、切片时组织蜡块质软不能切出完整切片形成空洞。如果随着蜡带连续深切,空洞越变越小,说明切片中的空洞是没有切全而造成的人为改变。组织处理过度质地硬脆、切片时进刀速度过快、过猛,造成组织中的小斑点、小斑块会从蜡块中脱落,在切片上留下一个个小空洞。这种情况在脱水、透明或浸蜡处理过度的淋巴组织中极易发生,若取材太薄易造成处理过度,切片时经常会出现空洞;切片太厚或烘烤不足;染色时造成切片脱落也会造成切片不完整。

>> 对策:

取材时标本的厚度要适中,不能太厚或太薄,保证组织有充分的固定。切片时如果遇到组织处理过度,质地硬脆的蜡块,可将蜡块在冰盘冷却片刻或用湿的棉花蘸一下;蜡块接触刀刃用力不能太猛太重,以减少出现人为的空洞现象;另外,组织切片不能过厚,烘烤切片温度和时间要合适。


8
切片有颤痕或碎沫

> 原因:

振颤或微小振动大多数是缘自于组织处理时过度脱水,但也可能因为刀钝、角度太大或切片速度太快,致使切片不是被切出来的而好像是被刮下来的;再者因为切片的动作太猛造成搓衣板样改变。

>> 对策:

组织脱水过度使组织缺少湿度,可以用湿的纱布、棉花或拇指蘸些温水在蜡块上轻轻涂抹,以增加组织蜡块的湿度;另外,切片时不能将蜡块放在冰箱或冷台上冷冻过度。


9
切片出现刀痕

> 原因:

切片上部沿刀刃有小缺口、划痕;刀刃上有蜡屑的积留。前者会造成切片中组织结构的分裂;后者则会留下轻微的痕迹。

>> 对策:

如果刀痕在刀移动后仍然停留在切片相同的区域,那么刀痕是蜡块内存有异物所致;如果消失了,那么刀痕是刀刃上的缺口造成。金属异物在蜡块中残留最容易损伤刀口,操作时要格外留意。刀背后面有时留有组织碎屑或石蜡残渣,也会使切片出现垂直于刀刃的条纹或痕迹,所以切片时必须保持刀刃的完好和清洁,将缺口位置移开或更换新刀片。


10
切片出现“地图纹”

> 原因:

可能是因为组织处理不当,漂片仪温度过高、水温过热,亦可能由于蜡块在冰箱或冷台冷冻过度,造成蜡块开裂所致。另外如果切片过薄或切片漂片时间过长,也会导致组织切片产生类似“地图纹”样的裂隙。

>> 对策:

漂烘仪的温度通常控制在低于包埋石蜡熔点的5~10℃左右,切片时尽量避免蜡块在冰箱或冷台冷冻过度。


11
切片出现皱褶

> 原因:

切片在漂烘仪水面没有完全展开形成皱褶。

>> 对策:

淋巴结组织通常是圆形、椭圆形或不规则形,在组织边缘特别是有包膜的边缘切片时很难展开,所以切片时可以先将蜡片或蜡带放在冷水中用镊子轻轻将皱褶撑开后再移入温水中稍展片刻,裱起即可。同时注意切片厚度不能太薄。


12
切片出现气泡

> 原因:

组织切片太薄、裱片水温太高时,切片容易出现气泡。组织切片在漂烘仪展片时形成的气泡经烘/烤片后,染色时气泡破裂造成破裂区域染色深染。

>> 对策:

切片刀要锋利,切片厚度通常以2~3μm为宜;烘片温度为68℃,时间为15~20分钟。切片太厚或烘烤片时间不够,染色过程中容易脱片。捞片水温不能太高,在45~48℃为宜,水温太高组织容易扩散造成破裂。


13
细胞核与细胞质染色模糊

> 原因:

通常由于淋巴组织切片厚薄不均匀造成。

>> 对策:

可以根据组织处理的情况严格掌握切片的厚度,通常切3~4μm,不能<2μm。常规用成熟的Grill苏木精染色3~5分钟,1%盐酸乙醇分化。不同厚度的淋巴结切片苏木精染色均应在显微镜下控制分色,另外染色液要定期更换,以免使用时间过久引起着色不良。



【参考文献】

1、病理技术大讲堂1001问-病理技术操作疑难点解惑答疑. 席越,陈军主编.人民卫生出版社


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