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离心机的那些事儿 | 常见离心方法,你知道的有多少?

2021.09.13

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        实验室离心机主要用于血液分离、病毒研究、DNA研究、药品提纯等实验中对溶液中密度不同的粒子进行分离。其广泛应用于临床医学,生物化学,基因工程,免疫学等领域,是各级医院、高等院校、科研单位用于离心分离的必备仪器。但是对于不同的样品分离,其离心分离法各不相同,适合的场合也尽不相同。那么常见的实验室离心机离心分离方法都有哪些呢?

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祥宝M1324R微量高速冷冻离心机

其中实验室离心的分离的方法主要有以下几种,差速离心法,密度梯度离心法、沉降平衡离心法以及分析性超速离心法。



差速离心法

        差速离心法是利用在离心力场中不同的粒子沉降系数的差别,通过逐渐提高离心力,使非均匀混合液内的不同大小、形状的粒子分步沉淀的离心方法。主要用于实验室样品分离,例如分离细胞器线粒体、叶绿体、蛋白质和病毒等。

分离步骤

第一步:设置较低的离心速度(相对离心力),先让较大的颗粒沉降到管底,而混合液中小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

第二步:收集沉淀,设置较高的离心速度(相对离心力)离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,后续依此类推,最终可分离不同大小的颗粒。


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差速离心示意图


优点:

1. 操作简单,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开; 

2. 可使用容量较大的角式转子,分离时间短、重复性高;

3. 样品处理量大。

缺点:

1. 分离复杂样品和要求分离纯度较高时,离心次数多,操作繁杂; 

2. 分辨率有限、分离效果差,不能一次得到纯颗粒; 

3. 壁效应严重,容易使颗粒变形、聚集从而失活。



密度梯度离心法

       密度梯度离心法又称为区带离心法,可分为速率区带离心法、预制梯度等密度离心法和自成梯度等密度离心法


速率区带离心法

       离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质,样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度,被分离的粒子在梯度液中沉降速度不同,离心时混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带,达到彼此分离的目的。主要用于科研及实验室特殊方面的样品组份的分离和纯化。这样只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离纯化,其纯度和回收率均可满足要求。


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 速率区带离心示意图


优点:

1. 一次分离纯化,组分的沉降系数相差 20% 以上的可选用此法;

2. 分辨力高,可以将组分沉降系数相差 5%~10% 的样品很好的分离。

缺点:

1. 材料限制,样品液浓度不能太高,对操作条件要求高;  

2. 与差速离心法相比,处理样品的量要小的多。


预制梯度等密度离心法

       预先在离心管内配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质,常用介质有蔗糖、CsCl、CsSO等,待分离样品一般铺在梯度液顶上,如需挟在梯度液中间或管底部,则需调节样品液密度。离心后,不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层,即达到等密度的位置而获得分离。


自成梯度等密度离心法

       某些密度介质经过离心后会自成梯度。常用介质有Percoll,而CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合,离心开始后,梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时,可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布,到达与其自身密度相等的梯度层里,即达到等密度的位置而获得分离。


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密度梯度离心示意图


优点:

1. 具有良好的分辨率,分离效果好;

2. 颗粒不会积压变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合;3适应范围广,即能分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度的颗粒。

缺点:

1. 样品浓度不能太高;达到平衡时间长


沉降平衡离心法

根据被分离物质的浮力密度差别进行分离,所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度,介质在离心过程中形成密度梯度,被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。

优点:

1. 此法更简便,更可靠,结果更精确,是常用的测量绝对分子量的方法。

缺点:

2. 平衡离心时间太长,常规沉降平衡法实验一次需要几十个小时,目前改用短池法可以缩减到十几小时。



分析性超速离心法

      分析性超速离心法主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的透明离心池和光学检测方法,以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。主要用于:⑴测定生物大分子的相对分子重量 ;⑵生物大分子的纯度估计;⑶分析生物大分子中的构象变化

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蛋白质分子三维构象图


优点:

1. 能分离一般离心机难以分离的物料;

2. 分析生物大分子中的构象变化,可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

缺点:

1. 需要专用设备,使用专用离心瓶, 专业操作。


以上离心分离法都是比较常见的实验室分离法,皆应用于实验室离心机。根据分离样品的要求,这些离心方法也可分为制备离心方法和分析离心方法两类。并且随着离心设备的迅速发展,各种离心方法也有了很大的完善和改进。


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